近日，中国科学院空天信息创新研究院研究员祁志美团队采用自主研发的高光谱表面等离子体共振显微镜（HSPRM），实现了组织切片非标记成像和组织折射率二维分布测量，为简单快速精准检测组织病理提供了创新思路。
组织切片病理检查是肿瘤诊断和疗效评估的金标准。传统检查方法需要对组织切片进行染色成像，染色是一个费时费力、不易精确控制的过程，还会影响组织的固有特性；此外，染色组织切片的图像分析结果依赖于专家经验，缺乏统一的科学判据。
针对上述问题，研究团队开展了基于多功能HSPRM的生物组织非标记成像研究，实现了非染色组织切片的SPR成像与折射率二维分布测定，建立了以正常组织与病变组织之间折射率差异性为判据的肿瘤组织识辨方法。这种方法能够避免复杂的组织切片染色流程，缩短检测时间，克服传统组织切片染色成像病理分析方法易受医师主观经验影响的缺点。
在研究过程中，研究人员攻克了两个关键技术难题：
一是，利用高折射率玻璃（RI = 1.805 @λ = 589.3 nm），制作等边三角形棱镜耦合器，取代以往使用的等腰直角三棱镜耦合器，确保SPR模式对组织切片的高清成像和大动态检测范围。
在宽光谱平行光束垂直入射棱镜折射面的条件下，全反射产生的消逝波的有效折射率达到1.563 @λ = 589.3 nm，高于绝大多数生物组织的折射率，从而抑制在组织切片内部高阶导模的消逝波耦合激励，使得系统只容许在金膜/组织界面上激励SPP模式，从而保证了单一电磁模式与组织切片相互作用；并将作用深度限制在SPP穿透深度内，无需考虑组织切片的厚度影响，使得测试结果简单明了，为仿真拟合实验结果进而求解折射率分布创造便利条件。
在此实验条件下，光源的宽光谱范围（400nm~1000nm）为组织切片的SPR成像分析提供了非常大的动态检测范围，远远超出正常组织与病变组织之间的折射率差异，在相同入射角下进行单次成像就能完全覆盖组织切片包含的正常区域和病变区域。
二是，利用射频溅射工艺，在金膜SPR芯片表面沉积一层SiO2超薄膜，改善芯片的生物亲和性，增强芯片与组织的粘附力，抑制组织切片的脱落，避免芯片与组织之间存在维纳间隙。实验结果表明，金膜SPR芯片经SiO2超薄膜修饰后，使组织切片牢固地附着在其表面，从而为长时间重复测量提供了保障。
使用实验室自主研发的HSPRM系统，在上述条件下对小鼠乳腺肿瘤组织切片和正常小鼠乳腺组织切片进行对比测量（测试结果如图所示），可以清楚看到肿瘤组织的折射率高于正常组织，这为基于折射率测量识辨肿瘤组织提供强有力依据。实验结果初步表明HSPRM具有优秀的生物组织非标记成像本领，有望成为非染色组织切片病理诊断的新工具。
以上相关成果以“Label-Free Imaging and Refractive Index Mapping of Biological Tissues by Hyperspectral SPR Microscopy”为题，在线发表在分析化学领域顶刊《Analytical Chemistry》，空天院博士生杨博为第一作者，祁志美为通讯作者。该研究成果得到国家自然科学基金（创新研究群体项目、重点项目）、空天院科学与颠覆性技术研究基金项目等资助。
论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c07441
采用HSPRM系统获得的非染色组织切片的实验结果（a1-a4为原始高光谱SPR图像及图像中标记的三个单像素的原始共振光谱；b1-b4为 600 nm波长处的SPR灰度图像；c1-c4为从实测单像素共振光谱中提取的共振波长二维分布；d1-d4为通过对共振波长进行仿真拟合获得的组织切片折射率二维分布；e1-e4为跨度为0.01的不同折射率区间内的像素统计。图中下标1、2代表癌症组织切片的两个不同区间，下标3、4代表正常组织切片的两个不同区间。）
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